Microbiología

Una de las finalidades de la microscopía es permitir observar los especímenes de la mejor manera posible, logrando un buen balance entre el contraste y la resolución. Esto es de extrema utilidad en muestras incoloras, tales como las células vivas, que en su estado natural son transparentes y con poco contraste, en las cuales los detalles permanecen invisibles a pesar de la resolución.

 

Microscopía óptica normal (de campo brillante coloreado).

 El material a observar se colorea con colorantes específicos que aumentan el contraste y revelan detalles que no aprecian de otra manera.

 

Microscopía de campo brillante.

El material se observa sin coloración. La luz pasa directamente y se aprecian detalles que estén naturalmente coloreados. El microscopio en campo oscuro utiliza una luz muy intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el espécimen. El campo de visión del objetivo se encuentra en la zona hueca del cono de luz y sólo recoge la luz que se refleja en el objeto. Por ello las porciones claras del espécimen aparecen como un fondo oscuro y los objetos minúsculos que se están analizando aparecen como una luz brillante sobre el fondo. Esta forma de iluminación se utiliza para analizar elementos biológicos transparentes y sin manchas, invisibles con iluminación normal.

 

Microscopía en contraste de fase.

Se usa principalmente para aumentar el contraste entre las partes claras y oscuras de las células sin colorear. Es ideal para especimenes delgados, o células aisladas. El microscopio de fase ilumina el espécimen con un cono hueco de luz, como en el microscopio en campo oscuro. Sin embargo en el microscopio de fase el cono de luz es más estrecho y entra en el campo de visión del objetivo, que contiene un dispositivo en forma de anillo que reduce la intensidad de la luz y provoca un cambio de fase de un cuarto de la longitud de onda. Este tipo de iluminación provoca variaciones minúsculas en el índice de refracción de un espécimen transparente, haciéndolo visible. Este tipo de microscopio es muy útil a la hora de examinar tejidos vivos, por lo que se utiliza con frecuencia en biología y medicina

 

Microscopía diferencial de contraste de interferenciam, Nomarski (DIC).

Utiliza dos rayos de luz polarizada y las imágenes combinadas aparecen como si la célula estuviera proyectando sombras hacia un lado. Fue diseñado para observar relieves de especimenes muy difíciles de manejar, es muy utilizado en los tratamientos de fertilización in-vitro actuales. DIC se usa cuando el espécimen es muy grueso para usar contraste de fases

 

Microscopía de Fluorescencia.

Una sustancia natural en las células o un colorante fluorescente aplicado al corte es estimulado por un haz de luz, emitiendo parte de la energía absorbida como rayas luminosas: esto se conoce como fluorescencia. La luz fluorescente de mayor longitud de onda se observa como si viniera directamente del colorante. Microscopio de fluorescencia: Microscopio que incorpora una lámpara especial, que actúa emitiendo una luz excitadora de los fluorocromos, con los que se tiñen las muestras a observar, y que posee además un filtro especial, que permite el paso de la luz emitida por el fluorocromo.

 

Microscopía  Confocal.

Un microscopio confocal es un microscopio capaz de obtener imágenes tridimensionales de la célula. Se basa en un principio similar al de un microscopio de fluorescencia, pero se utilizan dos diafragmas confocales (uno antes de la muestra y otro después) capaces de enfocar la iluminación en un único punto de la muestra. Se utiliza un láser como fuente luminosa, y con él se va barriendo la muestra por todo su volumen, plano a plano, creando muchas imágenes bidimensionales que un ordenador interpreta, generando finalmente una imagen tridimensional del objeto. Para observar preparaciones con este microscopio es necesario teñirlas con sustancias fluorescentes o marcarlas con sustancias conjugadas con fluorocromos, como los anticuerpos.

 

Microscopía Electrónica

Es una técnica que requiere instrumentos de alta complejidad y personal altamente especializado. Se utilizan la microscopía electrónica de transmisión o convencional y la de barrido.

Las muestras para microscopía electrónica deben fijarse en glutaraldehído, que se solicita a un laboratorio con las instrucciones para la toma y fijación de la muestra. Los fragmentos deben ser pequeños y tienen que fijarse en forma de varios trocitos cuboideos de tejido de no más de 1 mm, obtenidos con hoja de afeitar o bisturí limpios. Las muestras se incluyen en resinas sintéticas (Epon) y se practican cortes 10 veces más delgados que los de microscopía de luz llamados cortes ultrafinos. La tinción se realiza con sales de metales pesados como citrato de plomo, tetróxido de Osmio o acetato de uranilo, que permiten un contraste adecuado del tejido bajo el haz de electrones. Los cortes ultrafinos se montan sobre grillas de cobre, se tiñen y se observan al microscopio electrónico. Para documentar los hallazgos es necesario obtener fotografías en blanco y negro de las preparaciones. Las grillas, muestras, inclusiones y fotografías se guardan en un archivo especial durante años.